黃曲霉M1快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物黃曲M1將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭黃曲M1抗體，加入酶標記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物黃曲M1的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物黃曲M1的含量。
二、試劑盒特性
- 試劑盒靈敏度： 0.03ppb
u 孵育溫度： 25℃
u 孵育時間： 30min～15min
- 樣本檢測下限
牛 奶 ······································ 0.3 ppb
奶 粉 ······································ 0.12ppb
- 交叉反應率
黃曲 M1 ···································· 100%
- 樣本回收率
牛 | 奶 | ·································· | 90±25% | |
奶 | 粉 | ·································· | 85±25% | |
三、試劑盒組成 |
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1 | 微量測試孔 | 每條 8 孔，一板 12 條 | ||
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| 標準液×6 瓶 | 0ppb | 0.03ppb | |
2 | 0.06ppb | 0.12ppb | ||
（1ml/瓶） | ||||
| 0.24ppb | 0.48ppb | ||
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3 | 酶標記物 | 7ml | 紅色帽 | |
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4 | 抗體工作液 | 7ml | 藍色帽 | |
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5 | 底物 A 液 | 7ml | 白色帽 | |
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6 | 底物 B 液 | 7ml | 黑色帽 |
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7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
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8 | 20X 濃縮洗滌液 | 40ml | 白色帽 |
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9 | 2X 濃縮復溶液 | 50ml | 透明帽 |
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四、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標儀、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮吹儀、恒溫箱、打印機微量移液器：單道 20～200µl、單道 100～1000µl、多道 30～300 µl
試 劑：乙腈、乙酸乙酯
五、樣本前處理步驟
- 樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。
- 樣本前處理需配制：配液 1 樣本復溶液：
用去離子水將 2×濃縮復溶液按 1：1 稀釋。
配液 2 樣本提取液：
將乙腈與乙酸乙酯按 1:2 比例混合均勻（1份乙腈+2 份乙酸乙酯）。
- 樣本處理：
（a）牛奶樣本處理方法（適用于乳飲料）：
1、 取牛奶樣本 100µl，加入 900µl 去離子水，充分
振蕩混勻；2、 取 50µl 用于分析。
樣本稀釋倍數: 10 倍
（b） 奶粉樣本處理方法：
1、 取 1.0±0.05g 奶粉樣本于 50ml 離心管中；加入3ml 去離子水，再加入 8ml 樣本提取液，充分振蕩 3min，20℃ 4000r/min 以上離心 10min；2、 移取 2ml 上層清澈液到另一離心管中，50-60℃氮氣流下干燥；3、 用 1ml 正己烷溶解干燥的殘留物，再加入 1ml樣本復溶液充分混合 30s；20℃ 4000r/min 以上離心 10min；去除上層正己烷相；
4、 取 50µl 用于分析。
樣本稀釋倍數：4 倍
六、 酶標免疫分析程序:
- 測定前應須知：
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。
3、 在 ELISA 分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定程序中的要點。
4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
- 操作步驟：
1、 從 2～8℃冷藏環境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于 2～8℃。
3、 配液：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
4、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2 孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
5、 加標準品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物 50µl/孔，再加入 50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜蓋板，輕輕振蕩混勻，25℃環境反應 30min。
6、 將孔內液體甩干，用稀釋后的洗滌液 250µl/孔洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7、 顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B 液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光顯色 15min。
8、 測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/630n m 檢測，5min 內讀數），測定每孔 OD 值。
七、結果判定
結果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與其所含黃曲M1 量成負相關。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本 1 的吸光度值為 0.3，樣本 2 的吸光度值為 1.0，標準液吸光度值分別是：
0ppb 為 2.243；0.03ppb 為 1.816；0.06ppb 為 1.415； 0.12ppb 為 0.74；0.24ppb 為 0.313；0.48ppb 為 0.155。則樣本 1 的濃度范圍是 0.24ppb～0.48ppb；樣本 2
的濃度范圍是 0.06ppb～0.12ppb，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中黃曲M1 實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以個標準（0 標準）的吸光度值，再乘以 100%，即
B
百分吸光率（%）＝ ×100%
B0
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值（2）標準曲線的繪制與計算
以標準品百分吸光率為縱坐標，以黃曲M1標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中黃曲M1 實際濃度。
若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析.
八、 注意事項
1、 室溫低于 25℃或試劑及標本未回到室溫（20～
25℃）會導致所有標準的 OD 值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。
4、 反應終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能變質。
8、 該試劑盒理想反應溫度為 25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
九、儲藏條件和保質期
1、 儲藏條件：試劑盒于 2～8℃保存，不要冷凍。
2、 保 質 期：該產品有效期為 1 年，生產日期見包裝盒。
提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。
農業部生物毒素檢測重點實驗室 聯合研制
