口蹄疫病毒（通用型）檢測試劑盒（實時熒光PCR法）說明書
【產品名稱】
通用名稱：口蹄疫病毒（通用型）檢測試劑盒（實時熒光PCR法）
英文名稱：Foot and Mouth Disease Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規格】 25T/盒 & 50T/盒
【預期用途】
口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV) 屬于小RNA病毒科，口蹄疫病毒屬，主要侵害偶蹄獸，有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia-I七個血清型。口蹄疫發病以發熱、口腔黏膜及蹄部和乳房皮膚發生水泡和潰爛為特征，是獸疫局規定的A類傳染病，易通過空氣傳播，傳染性強，流行迅速，偶爾感染人。由于口蹄疫傳播迅速、難于防治、補救措施少，被稱為畜牧業的“*殺手”。
本試劑盒利用實時熒光PCR原理，定性檢測口蹄疫通用型病毒，對口蹄疫病毒引起的偶蹄獸類病的診斷和監控具有重要指導意義。
【檢驗原理】
本試劑盒針對口蹄疫病毒通用型的高度保守區域設計特異性引物和探針，在反應體系中含口蹄疫病毒通用型基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道信號進行實時監測和輸出，實現檢測結果的定性分析。
【主要組成成份】
序號 | 組成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
1 | 口蹄疫 RT-PCR反應液 | 375 μL×1管 | 750 μL×1管 |
2 | 口蹄疫 逆轉錄酶 | 50 μL×1管 | 100 μL×1管 |
3 | 口蹄疫 Taq酶 | 75 μL×1管 | 150 μL×1管 |
4 | 口蹄疫 陽性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
5 | 口蹄疫 陰性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
6 | 說明書 | 1份 | 1份 |
注：陰性對照為偶蹄獸類基因組DNA，陽性對照為失去活性的口蹄疫病毒cDNA。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列、湖南潤美系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
新鮮采集的咽拭子、皰疹液和糞便標本，并使用滅菌生理鹽水懸浮。
2.應避免標本間交叉污染。
3.標本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存于-80℃以下，避免反復凍融。
【檢驗方法】
1. 試劑準備（試劑準備區）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當次實驗所需要的反應數（n），并根據如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數（1T）+陽性對照數（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數
單反液配制表（1T） | RT-PCR反應液 | 15.0 μL |
逆轉錄酶 | 2.0 μL | |
Taq酶 | 3.0 μL |
(3)在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
2.樣本準備（樣本處理區）
用本公司病毒核酸提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μL、終體積25 μL/管，蓋好PCR反應管蓋，混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25 μL/管，蓋好PCR反應管蓋，混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。
4. PCR（PCR擴增區）
（1）取樣本處理區準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數進行PCR擴增。
反應體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集 FMDV病毒熒光信號 |
PCR 反應 條件 | 步驟 | 條件 | 循環數 |
反轉錄 | 42℃：10分鐘（min） | 1 | |
預變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
預擴增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
55℃：40秒（s） | |||
PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結束時采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。
【陽性判斷值或者參考區間】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數增長期。
2.標本結果判定：
（1）陽性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數增長期。
（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38范圍內。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結果Ct值仍在35～38范圍內，有明顯指數增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無Ct值。
【檢驗結果的解釋】
通道及檢測結果 | 標本檢測結果解釋 |
FAM | |
陽性（＋） | 標本中檢出口蹄疫病毒RNA |
陰性（－） | 標本中未檢出口蹄疫病毒RNA |
【檢驗方法的局限性】
【產品性能指標】 產品的低檢出限為102 Copies/mL，產品CV值≤5%。
【注意事項】
