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考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
可見(jiàn)分光光度法
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定，
確保蛋白濃度在0~1000µg/ml范圍內(nèi)。
測(cè)定意義
樣品可溶性蛋白質(zhì)含量常常用于酶活性計(jì)算。此外，可溶性蛋白質(zhì)含量也用于食品等質(zhì)量分析。
測(cè)定原理
在酸性溶液中，考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合形成藍(lán)色復(fù)合物；該復(fù)合物在595nm處有大吸收峰， 其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。該方法靈敏度高，適合微量蛋白質(zhì)分析。
自備儀器和用品
離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、移液器、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。
試劑組成和配制
試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1 瓶，4℃保存。
樣品中可溶性蛋白質(zhì)提取
1. 液體樣品：澄清無(wú)色液體樣品可以直接測(cè)定。
2. 組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10的比例（建議稱取約 0.1g組織，加入1mL提取液（自備，根據(jù)需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水）冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，即待測(cè)液。（動(dòng)物樣品常常需要稀釋）
3. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。
測(cè)定操作：
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min，蒸餾水調(diào)零。
2. 空白管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL蒸餾水，1000μL試劑一，混勻后室溫靜置10min，
于595nm比色，10~20min 完成比色，記為A空白管。
3. 標(biāo)準(zhǔn)管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL標(biāo)準(zhǔn)液，1000μL試劑一，混勻后室溫靜置10min，
于595nm比色，10~20min 完成比色，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。
4. 測(cè)定管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL待測(cè)液，1000μL試劑一，混勻后室溫靜置10min，
于595nm比色，10~20min完成比色，記為A測(cè)定管。
注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測(cè)定一次。
計(jì)算公式:
Cpr（µg/mL）= C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)
=50×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)
C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)品蛋白質(zhì)濃度，50μg/mL。
注意事項(xiàng)：
1.加考馬斯亮藍(lán)后，在10~20min 內(nèi)吸光值相對(duì)較穩(wěn)定，因此須在10~20min 完成比色。
2.不宜用石英比色皿，可用玻璃或塑料比色皿，測(cè)完成后立即用 95%乙醇沖洗。
3.測(cè)定前用1~2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，確保蛋白濃度在0~1000µg/ml 范圍內(nèi)，否則需要做相應(yīng)稀釋，使得稀釋后的結(jié)果在 0~1000µg/ml 范圍內(nèi)，然后再乘以稀釋倍數(shù)。
