牛副結核桿菌(MAP)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法） |
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牛副結核桿菌(MAP)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法）
【產品名稱】 通用名稱：牛副結核桿菌(MAP)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)
【包裝規格】50T/盒
【預期用途】 牛副結核病由副結核分枝桿菌引起的牛慢性增生性腸炎。呈世界性分布，中國也有發生。2～3歲的牛最易得病，表現為卡他性腸炎,長期頑固性腹瀉，極度消瘦。特征性病變為腸粘膜高度增厚并形成皺襞，在皺襞褶中藏有大量成堆的抗酸性桿菌，但無結核或潰瘍。本試劑盒適用于檢測牛消化道組織，糞便或血液等樣本中的牛副結核桿菌，適用于牛副結核桿菌感染的輔助診斷。
【檢驗原理】 本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術，設計1對牛副結核桿菌特異性引物，結合1條特異性探針，用熒光PCR技術對牛副結核桿菌的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】 -20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融不超過5次，有效期12個月。
【適用儀器】 ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。
【標本采集】 病死或撲殺的牛，無菌剪取腸道等樣品1g；活畜取消化道淋巴組織樣本或糞便樣本進行測試。
【保存和運輸】 上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月，標本運送應采用2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】 1. 樣品處理（樣本處理區） 1.1 樣本前處理 組織樣品：每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g，手術剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中；分泌液和血液樣品直接取100μL于1.5mL滅菌離心管中。糞便樣本懸浮離心后取上清100ul于1.5mL滅菌離心管中。
1.2 DNA提取 為了使實驗結果穩定、有效、可靠，建議使用商品化的DNA 提取試劑盒進行提取，嚴格按照對應試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制（試劑準備區） 根據待檢測樣本總數，設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測試反應體系配制如下表：
3. 加樣（樣本處理區） 將步驟1提取的DNA、陽性質控品、陰性質控品各取5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR擴增（核酸擴增區） 4.1 將待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽內； 4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為25μL； 熒光通道選擇：檢測通道（Reporter Dye）FAM檢測牛副結核桿菌，淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇ROX參比熒光。 4.3 推薦循環參數設置：
5. 結果分析判定 5.1 結果分析條件設定 設置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節Baseline的start值(一般可在3~15范圍內調節)、stop值(一般可在5~20范圍內調節)，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2 結果判斷 陽性：檢測通道Ct值≤35.0，且曲線有明顯的指數增長曲線。 可疑：檢測通道35.0<Ct值<38.0，且出現典型擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果出現Ct值<38.0且有典型擴增曲線者為陽性，否則為陰性。 陰性：樣本檢測結果無Ct值且無明顯的擴增曲線。
6. 檢測方法的局限性 ? 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關； ? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果； ? 陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果； ? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果； ? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果； ? 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果； ? 本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
7. 質控標準 陰性質控品：無明顯擴增曲線且無Ct值顯示； 陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且Ct值≤30； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
8. 性能指標 （1）敏感性：內控樣本敏感性為100%，綜合評價敏感性98%以上。最低檢測限不低于1000copies/ml。 （2）特異性：100%。 （3）穩定性：批內及批間差異≤3%。
【注意事項】 ? 所有操作嚴格按照說明書進行； ? 試劑盒內各種組分使用前應自然融化，完全混勻并短暫離心； ? 反應液應避光保存； ? 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊； ? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服； ? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染； ? 實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器； ? 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。 從2011年開始我們致力于在生命科學領域、生物醫學實驗技術及論文潤色服務，協助客戶各類實驗服務及論文潤色十余年，是客戶您值得信賴的科研合作伙伴! 如果您受時間、試驗條件等限制而無法完成您的課題研究，歡迎您與我們聯系。
實驗技術服務：
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