基于生物質譜的蛋白鑒定、定量、翻譯后修飾分析
實驗原理
蛋白質經過蛋白酶的酶切消化后成肽段混合物，在質譜儀中肽段混合物電離形成帶電離子,質譜分析器的電場、磁場將具有特定質量與電荷比值(即質荷比, M/Z) 的肽段離子分離開來,經過檢測器收集分離的離子,確定每個離子的MZ值。經過質量分析器可分析出每個肽段的MIZ.得到蛋白質所有肽段的M/Z圖譜，即蛋白質的--級質譜峰圖。離子選擇裝置自動選取強度較大肽段離子進行二級質譜分析，輸出選取肽段的二級質譜峰圖，通過和理論.上蛋白質經過胰蛋白酶消化后產生的--級質譜峰圖和二級質譜峰圖進行比對而鑒定蛋白質。根據離子源的不同，目前用于蛋白分析的主流質譜技術主要有電噴霧離子化質譜(ESHMS) 和基質輔助激光解析電離質譜(ML ADHMS)。質量分析器主要有四極桿分析器(QE).離 子阱分析器(Orbitrap)、飛行時間分析器 (MLADI-TOF) 。
生物質譜在蛋白分析方面的應用
1.蛋白鑒定:由于各種蛋白質的氨基酸序列(--級結構)不同，蛋白質被酶解后產生的肽段序列也各異，肽混合物質量數亦具有特征性，稱為肽質量指紋譜(peptide mass fingerprint, PMF) ，可用于蛋白質的鑒定。
2.蛋白定量:基于穩定同位素標記法，如SIL AC. QconCAT. iTRAQ等;基于質譜歸--化的非標定量法，如蛋白豐度指數法PAI、多肽匹配數、譜圖計數、碎片離子峰強度(iBAQ) , SWATH等。
3.蛋白翻譯后修飾:根據特定修飾基團的圖譜特點進行翻譯后修飾的鑒定和定位，包括磷酸化、糖基化、巰基和二硫鍵定
位、乙酰化、泛素化等。
實驗步驟
①組織或細胞蛋白提取;
②蛋白酶消化，將蛋白樣品制備成多肽;
③多肽抽提和質譜儀分析，產生肽段質荷比和肽離子質量;
④搜庫、打分、輸出排序;
⑤搜庫后分析，蛋白鑒定、定量或翻譯后修飾分析。
實驗完成周期及交付標準
1.實驗完成周期10~30天,
2.交付標準:
①主要儀器、試劑和實驗方法:
②包含protein ID. gene symbol. spectrum count. u-peptide. z-score.、 coverage等信息的蛋白鑒定列表;
③所有肽段信息表;
④質譜原始數據(raw data)。
需確認的信息
1.樣品:①如果樣品為蛋白質溶液，蛋白質總量≥300mg ;
②.如果是組織樣品，樣品總量≥0.1g;如果是細胞樣品，細胞數量≥107個;
③、如果是體液樣品，血清≥200ml,腦脊液≥200ml,尿液≥1ml, 淚液≥1ml;
2.樣品采集過程中使用到塑料制品時，盡量使用無色產品，以減少塑料制品中雜質對質譜檢測的影響;
3.確認樣品所屬種屬、分析需求。
文獻參考
[1]Liu Q, et al. In-depth proteomic characterization of endogenous nuclear receptors in mouse liver. Mol Cell Proteomics.2013;12(2):473-84.
[2]Ruprecht B, et al. MALDI-TOF and nESI Orbitrap MS/MS identify orthogonal parts of the phosphoproteome.
Proteomics.2016;16(10);:1447-56.
[3]Kobayashi D, et al. Identification of a specific translational machinery via TCTP-EF1A2 interaction regulating NF1-associated tumor growth by afinity purification and data-independent mass spectrometry acquisition (AP-DIASWATH).Mol Cell Proteomics.2018 Oct 31. PubMed PMID: 30381327.
實驗代做服務：
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