蛋白雙向2D-WB 電泳實驗服務
實驗技術簡介
2D-WB是雙向電泳與傳統western blot結合而成的一項技術。一般實驗流程 為抗原蛋白混合物先經雙向電泳分離,然后將凝膠蛋白轉印至支持膜上，再通過抗體雜交顯色。2D-WB技術可以檢測到抗原等電點或分子量發生的微小變化，在蛋白翻譯后修飾的研究中有很好的應用;而2D-WB結合質譜鑒定技術，可以從蛋白混合物中找到免疫原性更強的抗原。
2D Westerm blot概述
2D-WB是雙向電泳與傳統western blot結合而成的一項技術。一般實驗流程 為抗原蛋白混合物先經雙向電泳分離，然后將凝膠蛋白轉印至支持膜上，再通過抗體雜交顯色。2D-WB技術可以檢測到抗原等電點或分子量發生的微小變化，在蛋白翻譯后修飾的研究中有很好的應用;而2D-WB結合質譜鑒定技術，可以從蛋白混合物中找到免疫原性更強的抗原。
2D Western blot技術服務內容
1、蛋白質抽提與定量;
2、雙向電泳;
3、轉膜，封閉，孵育,顯示成像。
實驗操作流程
1、第--項電泳(IEF) ,膠條平衡，第二項電泳SDS-APGE.
2、第二項電泳結束后，取出凝膠進行轉膜，轉膜方法可選擇濕法轉移和半干法轉移。常用的膜是NC膜和PVDF膜。
3、封閉，5%脫脂奶粉或5% BSA封閉1小時(室溫)或過夜(4度)。
4、一抗孵育,根據抗體說明書選擇孵育時間，常規的孵育條件是室溫1小時或4度過夜，一抗孵育后取出膜
TBST洗滌3次，每次5分鐘。
5、二抗孵育:根據一抗選擇合適的二抗(抗鼠、抗人、抗兔等)，室溫孵育1小時后取出膜TBST洗滌3次,每次5分鐘。
6、顯影:將A、B底物按比例稀釋混臺均勻后滴在膜上，暗室中將膠片置于膜上,蓋上壓片夾,曝光一定時間后將膠片放入顯影液中進行顯影，直到出現清晰的蛋白質條帶，清水漂洗一下后在定影液中定影， 曝光時間需綜臺考慮蛋白質的上樣量，抗體稀釋濃度，抗體孵育時間等因素。
7、定影后，清洗膠片，晾干，標定marker,掃描圖片和2D Western blot圖片分析。
送樣須知，為了保證2D Western blot技術服務能順利進行,樣品寄送需滿足以下要求:
1、顧客提供:組織、細胞、蛋白質溶液等; 一抗(可交由研謹公司代購)。
2、運輸要求:干冰或液氮包裝寄送。
注:樣本應避免各類污染和反復凍融。
2D Western blot技術服務報告內容
1、蛋白質定量結果及電泳上樣量;
2、原始膠片、電子圖片及圖片分析結果;
3、2D Western blot完整的實驗報告，包括實驗步驟、使用儀器和試劑等。
附: 2D Western blot實驗步驟
1、2D Western blot蛋白質樣本制備,制備的主要原則是盡可能溶解全部蛋白質，破壞蛋白質與蛋白質間的相互作用，避免各類干擾物質，樣品制備與IEF兼容等。
2、雙向電泳的主要步驟，第-項電(IEF) ，膠條平衡，第二項電泳SDS-APGE.
3、第二項電泳結束后，取出凝膠進行轉膜，轉膜方法可選擇濕法轉移和半干法轉移。常用的膜是NC膜和PVDF膜。
4、封閉， 5%脫脂奶粉或5% BSA封閉1小時(室溫)或過夜(4度)。
5、-抗孵育,根據抗體說明書選擇孵育時間，常規的孵育條件是室溫1小時或4度過夜，一 抗孵育后取出膜TBST洗滌3次，每次5分鐘。
6、二抗孵育:根據-抗選擇合適的二抗(抗鼠、抗人抗兔等)， 室溫孵育1小時后取出膜TBST洗滌3次，每次5分鐘。
7、顯影:將A、B底物按比例稀釋混合均勻后滴在膜上,暗室中將膠片置于膜上，蓋上壓片夾，曝光一定時間后將膠片放入顯影液中進行顯影，直到出現清晰的蛋白質條帶，清水漂洗一下后在定影液中定影， 曝光時間需綜合考慮蛋白質的.上樣量，抗體稀釋濃度，抗體孵育時間等因素。
8、定影后，清洗膠片，晾干，標定marker,掃描圖片和2D Western blot圖片分析。
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