貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 英文名稱 | CAS號 | 產(chǎn)品特征 |
R21086-100ml | Trizol(總RNA提取試劑) |
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Js30876-100ml | 一步法總RNA提取試劑 | Trizol Reagent |
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產(chǎn)品簡介：
Trizol(總 RNA 提取試劑)
Trizol 是一種新型的用于細胞或組織的總RNA提取試劑，Trizol采用不
Invitrogen TRIzol相似的原理和方法，其顏色、抽提的方法和步驟不后者*相同。
Trizol 含酚和異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速裂解細胞或組織并且滅活核酸酶，保持
RNA 的完整性。加入氯防仿并離心后，溶液形成上清層為水相(無色)、中間層、下層為有機相(紅色)。上清層用異丙醇沉淀回收總 RNA，中間層用乙醇沉淀回收 DNA，下層用異丙醇沉淀回收蛋白。
Trizol 適用于從各種組織或細胞中快速分離總RNA，既可用于小量樣品(50～
100 mg 組織、5×10 細胞)，也可用于大量樣品(>1g 組織/>10細胞)。提取的總RNA質(zhì)
量高，可用于 North6ern blot、Dot blot、polyA 篩選、體外翻譯、RNase 保護分析和分子克隆。本產(chǎn)品具有以下特點：①適用范圍廣；②操作簡單，整個過程 1 小時內(nèi)完成；③
純度高；④污染少。
產(chǎn)品組成：
Trizol Reagent
100ml 4℃ 避光
自備材料：
1、試劑：無水乙醇、氯防仿、異丙醇、DEPC處理水等。
2、耗材：RNase 廣泛存在于人的皮膚上和體液及環(huán)境中，RNase 是導(dǎo)致 RNA降解的最主要物質(zhì)，非常穩(wěn)定。操作時應(yīng)佩戴一次性口罩、手套、帽子。塑料制品、玻璃和金屬物品、 實驗儀器等應(yīng)清除 RNase，移液器吸頭、EP 管等制品的 RNase free處理尤為重要。
3、儀器：低溫高速離心機、低溫冰箱。
操作步驟(僅供參考)：
1、樣品準備
⑴貼壁細胞：
①直接裂解：直接在培養(yǎng)瓶/皿中加入 Trizol 裂解細胞，每 10cm 面積加 1ml Trizol，用移液器吹打混勻。 2
②胰蛋白酶消化：用無菌 PBS 洗滌細胞后，加入含有 0.05～0.25%胰蛋白酶的 PBS 處理細胞，當(dāng)細胞脫離容器壁后，加入含有血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)，將細胞溶液轉(zhuǎn)移至無RNase 的離心管中，5000～6000g 離心 5 min，收集細胞沉淀，去除上清。收集細胞時一定要將細胞培養(yǎng)液去除干凈，否則裂解不*，降低 RNA收獲率。
⑵懸浮細胞：無需清洗細胞，直接 5000～6000 g 離心 5 min，收集細胞。每 5×10 ～10
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動⑶物組、織植：物取和新酵鮮母動細物胞或或者每植物1組0 織或細者菌-細7胞0℃加凍入存1組m織l ，Tr5i0z～o1l0。0mg 組織在液氮中充分研
磨或者加入 1ml Trizol 研磨或者用勻漿器勻漿處理。樣品體積一般不超過 Trizol體積的
10%。研磨要迅速，以 1min為佳。
⑷血液：取 0.5～1 ml 新鮮或凍存的血液，12000g 離心 5 min，去除血漿，加入 1ml Trizol， 充分振蕩混勻。
2、核酸分離：充分振蕩混勻(可以置于低溫/超低溫冰箱凍存 5～10 min 后，充分振蕩，反
復(fù) 1～3 次)，將裂解樣品或勻漿液室溫放置 5～10 min，使核蛋白不核酸*分離。
3、樣品分層：加入 0.2 ml 氯防仿/1ml Trizol，劇烈振蕩 15s，室溫放置 2～3 min。置于 4℃離心機，12000 g 離心 10～15 min。上層為水相，中間層和下層為有機相，RNA在上層水相。
4、沉淀 RNA：吸取上層水相(約 500μl)轉(zhuǎn)移至無 RNase 的離心管中(不要吸取任何中間層物質(zhì),否則會有染色體DNA污染)，加入等體積異丙醇混勻(或者加入1.2倍體積Trizol與用 RNA沉淀液，超低溫冰箱放置 2～3hr,可以大大提高 RNA回收率），室溫放置 15～20 min。12000g 4℃離心 10min，離心后管側(cè)或管底形成膠狀沉淀，棄上清。
5、洗滌 RNA：加入 1ml DEPC水配制的 75%乙醇/1ml Trizol洗滌沉淀(或者加入1ml
Trizol與用RNA洗滌液，可以大大提高RNA純度），室溫放置5～10min，7500g 4℃離心5 min，棄上清。室溫干燥5～10min，不宜過分干燥，否則 RNA難以溶解。
6、溶解 RNA：加入30～50ul RNase-free ddH2O充分溶解RNA，-70℃長期保存或直接用于后續(xù)試驗。對于肝、胰腺、腎等組織中 RNase 含量高的樣品，沉淀時用100%去離子甲酰胺溶解。
分析與定量：
1、測定樣品在 260nm 和 280nm的吸收值確定 RNA 的質(zhì)量。按 1OD=40pg RNA計算
RNA的產(chǎn)率。OD260/280 在 1.8～2.0 視為抽提 RNA 純度較好。濃度在 4μg/ml以上的樣品適于用分光光度計測定。
2、進行甲醛變性瓊脂糖電泳，確定RNA的完整性和污染情況。
3、核酸分析儀測定RNA的質(zhì)量和純度。
注意事項：
1、樣品保存：加入 Trizol 混勻后，樣品可在-70℃放置 1～2 月；RNA 樣品可以在 70%酒精中-70℃保存 2～4 周：如果需要長期保存，應(yīng)置于超低溫冰箱中保存。
2、Trizol是強腐蝕性物質(zhì)，污染皮膚或眼睛后，立即用清水或生理鹽水沖洗，必要時尋求 醫(yī)生的幫助。
3、Trizol 可常溫運輸，建議保存 4℃保存。
4、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
有效期：12 個月有效。
常見問題分析：
常見問題 可能原因
抽提得到的RNA沉淀未*溶解。
水相中混有有機相，從而存在蛋白質(zhì)和 DNA污染。
A260/ A280＜1.6 RNA樣品用水而不是 TE溶解。低離子濃度和低 pH 條件下，A280值會偏高。樣品勻漿時加的 Trizol 試劑太少，RNA 不蛋白質(zhì)、DNA未能*分離。
勻漿后樣品未在室溫放置或者放置時間太短，RNA不核蛋白未*解離。
樣品中含組織溶劑(如乙醇等)或堿性溶液，致水相減少或 pH升高。
DNA 污染
樣品勻漿時加入的試劑體積太少。如果存在 DNA污染，可用 DNA清除劑去除。水相中混有有機相，從而存在蛋白質(zhì)和 DNA污染。
RNA 產(chǎn)量低
RNA 降解
蛋白和多糖污染
樣品裂解或勻漿處理不徹底，RNA沒有被*釋放出來。得到的 RNA沉淀未*溶解。
抽提的RNA中含有 RNase。
組織或細胞不新鮮，樣品沒有及時被液氮凍存，導(dǎo)致組織或細胞中的 RNA 降解。溶液或離心管未經(jīng) RNase free 處理，RNase 的污染導(dǎo)致RNA被降解。
細胞在胰蛋白酶消化時間過長，導(dǎo)致未加 Trizol 前 RNA已經(jīng)部分降解。
電泳時使用的甲酰胺 pH小于 3.5，導(dǎo)致 RNA發(fā)生酸解。水相中混有有機相，從而帶有蛋白質(zhì)和 DNA。樣品中蛋白、多糖含量高或樣品量太大，細胞未裂解*。
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