石蠟冰凍切片TUNEL凋亡熒光
TUNEL凋亡熒光實驗原理
dUTP缺口末端標記(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL) 法檢測細胞凋亡的原理是當細胞發生凋亡時,DNA內切酶被激活，核小體間的基因組DNA被切斷，暴露的3-0H可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(TerminalDeoxynucleotidyl Transferase, TdT)加上帶有熒光素FITC標記的dUTP,從而可以通過熒光顯微鏡進行檢測。
TUNEL凋亡熒光實驗意義
1.TUNEL法是一種分子生物學與形態學相結合的研究方法，可對完整的單個凋亡細胞或者凋亡小體進行原位染色，可以準確反映細胞凋亡典型的生物化學和形態特征。
2.可用于石蠟切片、冰凍切片、培養的細胞等進行細胞凋亡檢測，靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學方法要高。
3.操作簡便快捷，在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。
TUNEL凋亡熒光實驗步驟:
1.石蠟切片TUNEL顯色法:
①石蠟切片常規脫蠟至水，脫蠟劑= =甲苯，至水劑乙醇;
②PBS漂洗3*5 min; .
③加入蛋白酶K工作液379C反應15-30 min, PBS漂洗3x5 min;
④4%多聚甲醛(pH7 4的PBS)室溫固定15-30 min, PBS漂洗3x5 min;
⑤浸入封閉液(3%H202)室溫封閉10 min, PBS漂洗3x5 min;
⑥參考使用試劑盒的說明書配制適量的TUNEL檢測液，其中含有TdT酶、熒光標記液、TUNEL檢測液;
⑦樣品上加入適量TUNEL檢測液，37°C避光孵育60 min, PBS漂洗3x5 min;
⑧選擇是否用DAPI復染細胞核;
⑨使用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下進行觀察。
2.冰凍切片TUNEL顯色法:
①新鮮組織經處理后，立即在恒冷冰凍切片機內切片，厚度為5~6 um;
②防脫玻片，貼片，室溫陰干約12h;③4%多聚甲醛(pH7 .4的PBS)室溫固定10 min,
PBS漂洗3x5 min;
④浸入封閉液(3%H20O2) 室溫封閉10 min, PBS漂洗3x5 min;
⑤浸入通透液(0.1%Triton X-100溶于PBS中)，室溫通透30 S-2 min;
⑥參考使用試劑盒的說明書配制適量的TUNEL檢測液，其中含有TdT酶、熒光標記液、TUNEL檢測液;
⑦樣品上加入適量TUNEL檢測液，37°C避光孵育60 min, PBS漂洗3x5 min;
⑧選擇是否用DAPI復染細胞核:
⑨使用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下進行觀察。
結果展示
實驗完成周期及交付標準
1.實驗周期: 1-2周
2.交付標準:蠟塊、切片、染色圖片.實驗報告(實驗步驟、試劑、耗材等)
需確認的信息
1.樣本的種屬
2.樣本的類型(固定的組織or蠟塊or切片)
3.是否提供試劑盒
4.拍照要求
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